好多实验齐需要同期抒发多个基因，具躯壳式包括两种或多种质粒的共转染、使用多个或双向启动子，或者构建双顺反子或多顺反子载体。多顺反子载体不错同期抒发来自兼并个mRNA的两种或多种寂寥的卵白质。现在，双顺反子载体或者多顺反子载体主要选拔2种政策，如下图所示：

政策（1）用IRES（里面核糖体干预位点）来同期抒发基因1和基因2，如下图所示。

对于IRES的留意试验不错浏览往期著作：

里面核糖体干预位点（IRES）的旨趣、时势和应用

政策（2）用2A肽（自我剪切肽）来同期抒发基因1和基因2，如下图所示。

对于2A肽的留意试验不错浏览往期著作：

什么是2A肽？2A肽在卵白串联抒发、病毒学和疫苗商讨中的应用

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IRES和2A肽介导的多基因抒发模式图（图片开首于addgene blog）

为什么要弃取多基因串联抒发（多顺反子载体）？

好多本领咱们并不是径直检测缱绻基因的抒发，而是建树了新的时势来将办法基因和请问基因（如荧光基因或抗性基因或荧光素酶基因等）同期抒发。行使这些请问基因好像通俗筛选或弃取高水平抒发缱绻基因的细胞。多顺反子质粒不错确保任何抒发符号基因的阳性细胞也应该抒发办法基因，因为它们齐来自疏导的转录本翻译而来。

尽管不错通过使工具有多个单独抒发盒的质粒来驱动多个基因的共抒发，但从兼并个转录本中抒发基因随机是有益的，超越是当唯有一部分质粒被包装用于病毒寄递时，或者两个或多个基因之间的相对抒发水平很迂回。

多顺反子载体抒发多个基因的旨趣：

科学家们在单股正链RNA病毒中发现了一些规章，从而好像从单个转录本中有用地翻译多个基因。

（1）IRES元件（里面核糖体干预位点）旨趣

真核生物的翻译频繁从5'帽子开动，因此每个mRNA只翻译一次。可是，一些双顺反子载体行使里面核糖体干预位点（IRES）元件来让单个mRNA 不错从多个位点开动翻译。IRES驱动的翻译肇端不错不依赖于mRNA的5’结尾的帽子结构。

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图片开首于addgene blog

在上图中，不错看到 IRES 元件充任另一个核糖体召募位点，从而导致来自单个mRNA的两种卵白质的共抒发。

IRES领先是在脊髓灰质炎病毒RNA中发现的，好像促进真核细胞中病毒基因组的翻译。从其时起，东说念主们仍是发现了各式IRES序列，大部分IRES来自于病毒，但也有一些来自细胞的mRNA。

IRES元件相配有用，常见于双顺反子载体中。但是，它们确乎有一些缺欠。这些元件相配大（500-600 bp），可能会在包装智商有限的病毒疗养载体中占用难得的空间。此外，使用 IRES 元件一次抒发两个以上的基因可能会失败。有大量商讨发现，IRES下贱基因的抒发量频繁低于IRES上游基因的抒发量。

（2）2A肽（自我剪切肽）旨趣

为了克服IRES元件的一些缺欠，科学家们将“自裂解”2A肽改编到多顺反子载体中。这些肽领先亦然在小核糖核酸病毒中发现，2A肽长度很短（约20个氨基酸），况且从疏导的mRNA中产生的多个基因的抒发量是同样的。“自裂解”可能并不透顶准确，因为2A肽被认为通过使核糖体跳过2A元件C 结尾肽键的合成来概念作用，导致2A序列结尾与下贱下一个肽之间的分手。“裂解”发生在2A肽结尾的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）残基之间，这意味着上游顺反子将在结尾添加一些独特的残基， 而下贱顺子将从脯氨酸开动。

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若是大家念念将办法基因与荧光卵白或其他请问基因共抒发，最浅易的时势是从仍是克隆了多顺反子元件和请问基因的质粒上替换办法基因。另外，还不错将2A肽和请问基因行为一个全体从质粒上PCR下来，然后插入到办法基因的抒发载体上去。

IRES和2A肽该选哪个？

（1）当条款2个基因抒发量疏导期，选拔2A肽。因为IRES上游基因的抒发量频繁高于IRES下贱基因的抒发量。

（2）由于2A肽的裂解发生在其C结尾的GP之间，因此2A肽会和protein 1和会，可能会影响protein 1的定位和功能（如下图所示）。况且2A肽在GP之间裂解会导致P氨基酸（脯氨酸）位于protein 2的肇端位置，也可能对protein 2的定位和功能产生影响。此时冷漠使用IRES元件。

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2A肽切割位点（Stefan Burén et al. 2012. PLoS One）

（3）不同2A肽的切割效果不同样，即即是切割效果最高的P2A也不成达到100%，因此会有一部分protein 1-2A肽-protein 2这么的和会卵白存在，可能会影响后续实验和检测。

需要知说念的是：IRES和2A肽不是相互摒除的，有好多实验室同期选拔行使2A和IRES元件来高效地抒发多个基因。

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